시험법 밸리데이션(Method Validation)- 직선성

밸리데이션의 개념중에 직선성(Linearity)이라는 표현을 들어봤을 겁니다. 

직선성은 말 그대로 직선적인 성질을 나타내는지를 의미합니다. 

 

수학시간에 일반적인 직선식은 y= ax+b라는 식을 연상하면 됩니다. 

 

x축을 농도라고 하고 y축을 반응단위라고 합니다. 우리가 HPLC를 사용하는 경우는 통상 반응단위가 Peak area(피크면적이라고 하지요)으로 표현하고 UV를 사용하는 경우는 Abs(흡광도라고 합니다)로 봅니다.  

농도에 따라서 아래의 그림과 같이 직선을 보이는 경우는, 농도가 증가함에 따라서 반응하는 단위도 커진다. 그것이 곧 비례한다는 의미로서 예를 들어 아래의 그림처럼 4.01 농도(단위가 없네요 4.01ppm이라고 합시다)에서 반응의 정도가 41(Peak area)라고 합시다. 이때 직선성을 띤다, 또는 비례한다라고 말할 수 있는것은 그보다 높은 농도인 8.2 ppm 농도일때 반응의 정도도 41보다는 당연히 높아지면서도 비례하도록 높아지는 82peak 부근이 되는것을 의미합니다. 

 

결국 어떤식으로든 직선성을 띤다는 것의 의미는 농도가 증가할수록 반응이 커진다, 반응값이 증가한다라는 것을 의미하죠. 이렇게 직선성을 띠어야만이 우리는 모르는, 미지의 농도를 예측가능하고 분석이 가능한것입니다 .

 

어떻게 분석하느냐고요?

바로 이렇게죠. 

분석을 했습니다. 농도를 1.01, 2.05, 4.10, 8.20, 16.40 ppm 5가지로 만들어서 HPLC로 분석했더니 Peak area가 10, 20, 41, 82, 162이 나왔다고 가정하면 위와 같이 직선그래프를 그릴 수 있습니다. 지금은 엑셀시트로 편리하게 작성하면 직선식도 구할 수 있고 상관계수(r)와 결정계수(r2)도 알아서 구해줍니다. r2 값은 1에 가까울 수록 직선성을 가진다고 판정합니다. 

 

위와 같이 직선을 그어놓고 이제 해야할 일은, 미지의 성분을 분석하는 일이 남은 것이죠. 

 

농도를 위와 같이 한정하여 분석했고, 미지의 물질의 농도를 모르니 미지의 물질을 먼저 HPLC에 찍어봅니다. 그랬더니 결과값이 예를 들어 반응한 결과(Peak area라고 해야겠죠 지금 여기서는 HPLC로 분석했으니까요) 30이 나왔다 라고 하면(농도가 얼마나 나올지 예상되지요;) 거꾸로 y값에  30을 대입하여 해당하는 농도를 계산하는 겁니다.   

y= 9.9136x + 0.125라는 식에 30= 9.9136x+0.125

29.875 = 9.9136x

∴ x= 3.014 정도 나옵니다. 

 

위와 같이 분석하고자 하는 물질의 미지농도를 계산하기 위한 검증의 절차로 해당물질이 직선성을 보이는지 여부를 확인하는 것이 곧, 밸리데이션 항목 중에서도 직선성입니다. 

 

만든다고 만들었는데 직선성을 보려고 농도별로 만들어 기기에 찍었는데 r2값이 너무 터무니없게 1과 멀어져있다? 라고 한다면 첫번째 손을 의심하세요. 정확하게 한다고 자동피펫으로 사용하고 부피플라스크로 정확하게 표선 한다고 했어도 대부분의 초보들이 실수하는 것은 값이 튀는 것입니다. 5가지 농도를 만들었는데 다 맞는데 어찌하다보니, 중간에만 반응값이 41이 나와야하는데 30이 나왔다? 이것은 거의 99% 해당 샘플을 잘못만든 것이 맞으므로 잘못된 농도만을 다시 희석해서 만들거나, 처음부터 dilution과정을 다시 해보면 됩니다. 

 

두번째로 분석 물질이 용매에 대한 용해도가 떨어지는경우 r2값이 나오지 않습니다. 물질마다 용매에 대한 용해도가 모두 다르기 때문에 이럴 경우는 물질에 대한 정보 또는 문헌검색을 통해서 해당 물질의 용해도를 조사하고, 혹시라도 난용성물질이다라고 하면 유기용매의 비율을 높이거나 혹은 그 성분이 잘 녹을 수 있는 용매를 써보는 방법을 통해서 반드시 제일 고농도의 표준원액을 완전하게 녹여서 시험하도록 합니다.