시험법 밸리데이션(Method Validation)- 특이성

지금의 코로나19 팬데믹 시기는 우리의 일상을, 우리의 생활패턴을 완전히 바꾸어 놓았습니다. 언제쯤 우리의 일상이 돌아올 수 있을까 막연하게 느껴졌었는데, 얼마 전 잔여 백신을 맞으면서 그 희망의 빛이 조금씩 보입니다. 

 

약 12년 전에 이 정도의 팬데믹은 아니였지만 신종플루, 지금의 독감이죠. 그것이 한참 유행하면서 회사에서 서로 앞다투어 먼저 신종플루치료제 제네릭 허가를 받기 위해서, 당시 주말이고 평일없이 밤세워 실험하고 보고서를 썼던 기억이 있습니다. 

 

제가 근무했던 제약회사에서 그렇게 고군분투하여 실험하고 자료 제출하여 최초로 오리지널약인 타미플루의 제너릭 제제를 처음으로 허가를 득했었어요.  그때 포상금, 상품권 등 수고했다고 부장님께서 직접 지급해주었던 기억이 생생하네요. 

 

타미플루의 주성분인 오셀타미비르에 대해서 시험법(분석법) 밸리데이션을 수행했었는데, 지난번 포스팅에서는 시험법 밸리데이션에 대한 개념을 설명했고 오늘은 그럼 그 밸리데이션을 어떻게 해야하는건지, 필수적으로 확인해야하는 것들을 예시를 들어 설명하겠습니다. 

 

시험법(분석법)의 경우, 자체적으로 시험법을 개발하는 경우도 있고 공정서(미국약전USP, 대한약전 KP, 유럽약전 EP 등)나 논문등을 통해서 서치합니다. 그리고 회사가 보유하고 있는 분석장비 예를 들어 우리는 HPLC가 있어~ 그럼 가능하면 HPLC 분석법을 찾아보겠죠. 우리는 UV밖에 없어 하면 UV 분석법 위주로 찾을 것입니다. 예비시험을 통해서 해당 분석이 가능한지 여부를 먼저 실험합니다. Standard solution(표준액)이라고 해서 표준품을 가지고 원하는 농도를 만들어서 실제 분석기기에 넣어 찍어보는거죠. 오셀타미비르를 분석할 예정이니 오셀타미비르 표준품이라는 것을 시약상으로부터 구매해야합니다. 샘플로 타미플루제재(실제 약)을 사놓았으니 그걸 녹여서 분석해볼까? 도 생각하시는 분도 있겠지만, 가능하다면 순수하게 분석하고자 하는 물질만으로 있으면서 순도가 높은 표준품이라는 것을 이용하여 분석하는게 가장 좋습니다. 왜냐하면 그 제제(약)은 주성분 뿐만 아니라 그 약을 구성하도록 추가한 다른 부형제(첨가제)이 있기 때문에 주성분만을 분석하는데 있어서 방해를 줄 수가 있거든요. 

 

여기서 밸리데이션이 시작하는 거랍니다. 

밸리데이션에서 봐야하는 항목이 몇개 더 있지만, 제가 봤을 때 중요하다고 보는 요소인 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계 정도로 오늘은 설명드릴게요.  듣기만해도 어렵지만 실상 그렇지는 않아요. 

 

1) 특이성 : Specificity 로서 불순물이나 분해물, 배합성분 혼재상태에서도 분석대상하는 물질만을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력입니다. 다시 말하면 여러가지 물질의 존재속에서 a,b,c,d 중에서 내가 c만을 분석하고 싶은데 그것을 선택적으로 측정하는 것을 말합니다. 특히 확인시험, 순도시험, 정량시험에서는 반드시 특이성이 평가되어야 하죠. 내가 아세토아미노펜만을 분석하려는데 다른 방해물질 없이 그 성분만을 특이적으로 구별할 수 있는 방법을 입증하면 됩니다.  아래는 기체크로토그램을 하나 예시를 들어볼께요. 

중간에 톨루엔(Toluen)의 피크 유지시간은 약 8분이죠. 현재 분석조건에서 여러가지 혼합물을 분석할 때 8분 근처에 저렇게 피크가 나와있는것을 확인하기 위해서 해야할일은?

 

위의 그래프는 혼합물(MTBE, Benzene, Toluene, Ethylbenzene, p&m-xylene, O-xylene 표준품을 일정량) DMSO라는 용매에 모두 녹여서 가스크로마토그래피(GAS-Chromatography, GC)라는 분석기기로 측정한 결과를 나타낸 그래프라고 칩시다. 

그렇다면 공시험액(DMSO, 용매)만을 찍어도보고 MTBE만 넣어서 찍어보고, Benzene만 찍어보고 각각 1개씩만 넣어서 찍었을 때와 혼합물을 모두 넣었을 때를 찍어보고 각 그래프의 아래 x축에 있는 유지시간(분)으로 확인하는 겁니다. 

 

아 이런 분석조건에서 MTBE는 3분대에 나오고 Benzene은 5.5분 부근에 나오는구나를 확인한 후에

모두 합쳐서 찍어보고 재확인 하는겁니다. 아 8분대 나오는건 톨루엔이였구나! 라고.

 

이것이 특이성입니다. 

 

하지만 Ehtylbenzene과 P&m-xylene은 피크가 좀 붙어있죠? 가능하다면 이 피크는 분리도(Resolution)을 향상시켜서 완전하게 분리하는 것이 좋으며 (통상 분리도 1.5이상) 그래야만 특이적으로, 선택적으로 구별할 수 있는 방법이라는 것을 입증하는것이 가능합니다.  개념만 이해하시면 됩니다.